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      1. 操作指南

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        EB病毒原位雜交檢測試劑盒
        作者: 發布于:2019/5/3 9:12:29 點擊量:

        EB病毒原位雜交檢測試劑盒

        一、試劑盒介紹:貨號:EB-1803

        試劑1

        玻片處理液A

        50毫升

        試劑2

        生物素標記的EB探針雜交液

        5毫升

        試劑3

        HRP標記的抗生物素抗體溶液

        5毫升

        試劑4A

        DAB顯色液A

        0.5毫升

        試劑4B

        DAB顯色液B

        0.5毫升

        試劑5

        蛋白酶K緩沖液

        50毫升

        試劑6

        PBS緩沖液

        1000毫升×2

        試劑7

        2xSSC緩沖液

        1000毫升×4

        試劑8

        蘇木素染液

        50毫升










        1)檢測原理:

        EB病毒屬DNA類的皰疹科病毒,能特異性嗜淋巴細胞。通過接觸傳播,將侵入鼻咽部的淋巴樣組織或其他腫瘤組織內部。主要侵犯的是B淋巴細胞。EB病毒在自然界廣泛存在,與鼻咽癌發病密切相關、還腸道腫瘤以及傳染性單核細胞增多癥有關,此外還和淋巴瘤發病密切相關,如霍奇金淋巴瘤,Burkitt淋巴瘤等、慢性疲勞綜合征、器官移植等。

        EBEREB病毒編碼的小RNA,在EB病毒感染的細胞核內出現。對EBER進行克隆、合成標記的EBER RNA探針,可用于冰凍切片、石蠟切片、細胞涂片、細胞爬片,具有較高的特異性和靈敏度。


        2)試劑盒特點:

        本試劑盒采用生物素標記探針,辣根過氧化物酶系統DAB顯色劑,敏感性強;蛋白酶K消化,穩定可靠;37雜交即可;常溫PBS洗滌;一步檢測。

        3)試劑盒成份:

         

        4)保存條件

        Ø  所有試劑2-6℃保存;

        Ø  試劑盒在有效期內的穩定;

        Ø  不要使用已經過期的試劑;

        Ø  用前,將所有的試劑恢復至室溫(20-25℃),探針溶液必須混勻;

        Ø  應帶手套操作,使用新鮮二甲苯及乙醇溶液。

        二、     檢測預準備

        l  DAB顯色液:將試劑4A4BPBS按體積比1:1:18的比例混合,按實際需要量配制,即配即用。

        l  PBS配制:將一袋PBS粉末溶于1000毫升雙蒸水,徹底溶解,混勻后使用。

        l  SSC緩沖液:將一袋SSC粉末溶于1000毫升雙蒸水,溶解,混勻后使用。

        三、 檢測步驟

        1.   烤片:將組織切片置于烤箱或加熱板,在85℃的溫度下加熱20分鐘。.

        2.   脫蠟:把加熱后的組織切片浸泡在二甲苯溶液中,五分鐘一次,總計三次。再將組織切片依次放入梯度乙醇100%、85%75%中,每次3分鐘。用蒸餾水洗滌2分鐘。

        3.   再用,3%的雙氧水浸泡組織切片15-25分鐘,用蒸餾水洗滌2分鐘。

        4.   在組織切片或細胞上滴加200-300μl 玻片處理液,在常溫下浸泡20分鐘,用PBS洗滌5分鐘。

        5.   每一個載玻片上滴加200-300μl 蛋白酶K緩沖液,使之覆蓋細胞,放入濕盒中,在37℃的干燥箱中培養15分鐘,用PBS洗滌3次,每次5分鐘。

        6.   每一個組織切片上滴加30-50μl的含有生物素標記的EB探針的雜交液,蓋上蓋玻片,在95℃的加熱板上加熱5min,再放入濕盒中,在37℃的干燥箱中放置至少16h。

        7.   取出濕盒中的組織切片,用2xSSC溶液洗滌15 min。

        8.   在組織切片中加入30-50μl/片的HRP標記的抗生物素抗體的溶液,常溫下孵育1小時,用2xSSC洗滌15分鐘。

        9.   加適量配制好的DAB顯色液,顯色5-15分鐘,注意光鏡下觀察顯色情況。用蒸餾水沖洗1分鐘。

        10. 滴加適量蘇木素復染,染色約1min,用蒸餾水或去離子水短時間沖洗,浸泡PBS 10分鐘返藍。

        11. 封片:依次放入梯度乙醇溶液(75%、85%、100%)中各3min,再放入二甲苯溶液中,10分鐘。滴加中性樹脂,蓋蓋玻片,常溫保存。兩年內不褪色。

        四、 結果評判:

        1)陽性結果出現在細胞核上,顏色顯示深棕色或淺棕色,與EB含量有關,陰性結果是核上無棕色。

        2)細胞漿,紅細胞染色是非特異的,因為部分血液細胞、紅細胞、內分泌細胞存在內源性酶或生物素。

         




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